O princípio de funcionamento e preparação do tripéptido reagente Limulus/substrato de endotoxina

O tripéptido reagente Limulus é uma substância tripeptídica com uma sequência específica extraída do lisado de células sanguíneas do caranguejo-ferradura ou sintetizada artificialmente. O tripéptido reagente Limulus é um substrato cromogênico usado para análise quantitativa (como o teste de endotoxina bacteriana) para detectar e medir os componentes de bactérias Gram-negativas—endotoxinas. Quando atuado por enzimas ativadas por endotoxinas, um composto colorido (como a p-nitroanilina) é liberado, permitindo que a intensidade da cor seja medida e correlacionada com o conteúdo de endotoxinas.

Princípio de funcionamento

Ativação de endotoxinas: Na presença de endotoxinas, os amebócitos no sangue do caranguejo-ferradura liberam enzimas, desencadeando assim a cascata de coagulação.

Ação da enzima: A enzima ativada (geralmente enzima de coagulação) atua então sobre um substrato cromogênico.

Reação Cromogênica: A enzima cliva o substrato, liberando um composto amarelo chamado p-nitroanilina (pNA).

Análise quantitativa: A intensidade da cor amarela é proporcional ao conteúdo de endotoxina na amostra e geralmente é medida usando um espectrofotômetro com absorvância de 405 nm.

Métodos de preparação

O tripéptido reagente Limulus pode ser obtido através de duas abordagens em termos de preparação.

1. Extração de componentes naturais das células sanguíneas Limulus e obtenção do tripéptido ativo através de separação e purificação.

2. Usar tecnologia de síntese em fase sólida para conectar sequencialmente sequências de aminoácidos específicas, controlando com precisão a estrutura do tripéptido.

Devido às políticas de conservação para Limulus (com províncias como Zhejiang, Fujian, Guangdong e Guangxi listando-o como uma "vida selvagem aquática protegida de chave provincial" / Hong Kong emitiu regulamentos no final de 2012 proibindo a pesca de arrasto de fundo), e porque o processo de extração é complexo e desafiador, o custo do primeiro método é relativamente alto. Portanto, a síntese em fase sólida é agora comumente usada. Ao conectar sequencialmente sequências de aminoácidos específicas, a estrutura do tripéptido pode ser controlada com precisão. Este método não só garante a estabilidade e consistência do produto, mas também permite a produção em larga escala, atendendo às necessidades da indústria farmacêutica para testes de reagentes.